非变性PAGE电泳试剂盒(中pH)

产品货号：

BTN81212B

中文名称：

非变性PAGE电泳试剂盒(中pH)

英文名称：

One-Stop Protein Native PAGE Kit(Medium pH)

产品规格：

30T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，跟SDS-PAGE根据分子量大小分离蛋白质不同，它主要根据蛋白质的pI分离蛋白质。由于蛋白质的pI各不相同，所以对不同靶蛋白质需要选用具有不同pH的电泳体系。单独配制不同pH的Native PAGE电泳胶十分繁琐，为此百奥莱博公司开发了本试剂盒。

即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。
非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性（而SDS-PAGE得到的蛋白没有活性）。
可以用于分析蛋白质和DNA或RNA的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。
电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交等实验。
本试剂盒足够30次mini PAGE电泳。

组分	规格
丙烯酰胺干粉	60g
甲叉双丙烯酰胺干粉	3g
TEMED	1.5mL
过硫酸铵干粉	1g
4×中pH浓缩胶配胶液(pH5.5)	100mL
4×中pH分离胶配胶液(pH7.5)	200mL
中pH电泳液干粉A(pH7.0)	55.2g
中pH电泳液干粉B(pH7.0)	10g
5×中pH上样液	1mL

保存：室温，其中上样液需置于-20℃，有效期1年。

用户自备

去离子水、天然PAGE蛋白质标准或蛋白质等电电泳标准品

使用方法

一、配制分离胶

确定浓度。对分子量在100kD以上的蛋白，可选用3～5%的胶；对分子量在20～150kD之间的蛋白质，可选用5～10%的胶；对分子量在10～80kD之间的蛋白质，可选用10～15%的胶。对未知样品，建议使用7.5%的胶。
配制10% APS：按每0.1g过硫酸铵干粉加1mL去离子水的比例配制10%的APS溶液，该溶液可以在4℃存放一周。
配制30% Acryl/Bis(19:1)：在装有60克丙烯酰胺干粉的瓶中加入146mL自备的去离子水和3g甲叉双丙烯酰胺，充分摇晃直到溶解（约需10～20分钟）即得200mL 30% Acryl/Bis(19:1)。
- 此溶液最好在一个月内用完，必须4℃避光保存。
配10mL分离胶：在一个25mL的三角瓶中，先加入4.2mL去离子水、3.3mL 30% Acryl/Bis(19:1)和2.5mL 4×中pH分离胶配胶液(pH7.5)。
- 如果配制其他体积，请按比例调节各成分用量。
摇晃混匀后抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气。
- 氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应。
加入50μL新配制的10% APS和10μL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
- 这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则按比例增加。
在胶面距离顶部1-1.5cm的时候停止灌胶。然后覆盖一层1～5mm厚的水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不会混合。
室温聚合30～60分钟后，用1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

二、配制浓缩胶
浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用浓度为4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩胶pH跟分离胶pH不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品，可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。

配10mL浓缩胶：在一个25mL的三角瓶中，先加入6.2mL去离子水、1.3mL 30% Acryl/Bis(19:1)和2.5mL 4×中pH浓缩胶配胶液(pH5.5)。
- 如果配制其他体积，请按比例调节各成分用量。
摇晃混匀后抽真空10～15分钟以去除溶液中的氧气。
- 氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应。
按上表用量加入50μL 10% APS和15μL TEMED，迅速摇匀后在已经凝固的分离胶上倒胶。
- 这是配制10mL胶的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加。
在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
室温聚合30～60分钟，拔出梳子，用1×电泳液冲洗加样孔。
- 1×电泳液配制：称取5.52g中pH电泳液干粉A(pH7.0)、1g中pH电泳液干粉B(pH7.0)混匀，加去离子水至彻底溶解，调pH到7.0，定容至1L，配制成1×电泳液。客户根据可实际需要量按比例增减。

三、电泳

将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够1×电泳液。
连接电极。如果浓缩胶和分离胶的pH高于靶蛋白pI，靶蛋白将带负电荷并向阳极移动，可以按标准的SDS-PAGE方法接通电极（上阴极下阳极）；如果浓缩胶和分离胶pH低于靶蛋白pI，靶蛋白将带正电荷并向阴级移动，此时应该下阴极上阳极。
300V预电泳直到电流不再降低（约需要30分钟）以去除残留过硫酸铵。
换电泳液。
在液体蛋白质样品中加入5×中pH上样液（16μL液体样品加4μL上样液）后上样。0.75mm厚的胶可以上10μL，1.5mm厚的胶可以上20μL。在未用加样孔中也要加1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。
- 如果用考染检测，每个孔的蛋白最好在50～100μg总蛋白，如果银染则只需要1μg即可。样品如果是蛋白质沉淀，可用1×上样液直接溶解蛋白质沉淀后再上样。
- 蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液pH的残留成分（如蛋白质沉淀剂TCA），用前最好用pH试纸测试一下，不在上样液的pH范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调pH。
上样自备的天然PAGE蛋白质标准或等电电泳的标准品（如果有的话）。
用15 mA（对0.75mm厚的胶）或30mM（对1.5mm厚的胶）的电流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要1～2小时。
- 电泳过程最好在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。
终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（如染色或酶活性检测）。

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